Иммуноферментный анализ вироза

Иммуноферментный анализ вироза – наиболее распространённый способ идентификации вирусов и вирусных заболеваний растений, при котором используются антитела, связанные с ферментом химически, а после добавления субстрата, в результате ферментативной реакции, наблюдается образование окрашенного продукта[2].


Сегодня известно несколько десятков вариантов ИФА. Наибольшее распространение имеет гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent). Многие компании освоили производство оборудования и диагностических наборов для ELISA. Для большого числа фитопатогенных вирусов производятся и продаются готовые к использованию коммерческие диагностикумы[2].

Основы методик ИФА

Иммуноферментный анализ применяется для диагностики вирусов с любой формой вирионов. Используется для выявления вирусов, бактерий, грибов в растениях. По сравнению с серологическими методами иммунодиагностики вирозов, ИФА имеет более высокую чувствительность, превосходя их на 2–3 порядка. При этом для идентификации вируса требуется минимальное количество сока, всего несколько миллиграмм[1].

Диагностические методики, основанные на ИФА, существуют благодаря двум фундаментальным открытиям:

  1. Антитела, нековалентно связанные с твердым носителем, и ферменты, ковалентно связанные с антителами или антигенами, не теряют биологическую активность. Таким образом, иммобилизованные антитела продолжают связывать антигены, а связанные ферменты способны расщеплять субстраты[2].
  2. Конъюганты антител с ферментами обладают высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к антигенам. Они способны распознавать и избирательно связывать тот антиген, против которого они были получены. Каждая молекула антитела несет только одну молекулу фермента. При этом фермент катализирует превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Это способствует зафиксировать наличие гомогенного антигена даже при незначительных его количествах[2].

Принцип методик ИФА

Иммуноферментный анализ основан на адсорбции антител, специфичных для определенного вида вируса на пластиковых планшетах с 96 углублениями-лунками.Применяется ИФА в нескольких различных модификациях. Ознакомимся с «сэндвич»-методом, общая схема которого выглядит следующим образом[1]:

  1. В углубления-лунки пластикового планшета добавляется раствор антисыворотки[1].
  2. Производится инкубирование в течении 1 часа при +37ºС или при +4ºС в течение ночи[1].
  3. Неадсорбированные антитела отмываются и в лунки добавляется сок исследуемого растения. Присутствие вируса в соке приводит к его реакции с адсорбированными антителами и возникновение связи с планшетой[1].
  4. Производит ещё одна инкубация и отмывка[1].
  5. В лунки добавляется конъюгант (раствор, содержащие антитела, связанные с ферментом). Обычно используют следующие ферменты: щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена. При наличии вируса наблюдается его связывание с ферментом[1].
  6. Проводится третья инкубация в течение двух часов про +37ºС и промывка для удаления несвязанного конъюганта[1].
  7. В ячейки добавляется энзимный субстрат (хромоген). Его вид зависит от использованного фермента. В частности, если в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, то субстратом служит n-фенилнитрофосфат. Если ферментом была пероксидаза, то – 5-аминсалициловая кислота или ортофенилендиамид[1].
  8. Проводится ещё одна инкубация и измеряется активность энзима. Количество реагента прямо пропорционально количеству вируса. Интенсивность его окраски пропорциональна концентрации вируса[1].

Результаты реакции определяются визуально или замеряется с помощью специального сканирующего прибора[1].

 

Оставьте свой отзыв:

Отзывы:

Комментарии для сайта Cackle

Составитель:

 

Страница внесена:

Последнее обновление: 13.01.21 01:02

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Литературные источники:
1.

Власов Ю.И., Ларина Э.И., Трускинов Э.В. Сельскохозяйственная фитовирусология СПб.- Пушкин: ВИЗР, 2016. — 236 с. Приложение к журналу "Вестник защиты растений", Выпуск 17.

Источники из сети интернет:
2.

Дьякова Ю.Т., редактор, Фундаментальная фитопатология. – М.: КРАСАНДР, 2012 – 512 с.

Свернуть Список всех источников