Культивирование зоопатогенных вирусов

Культивирование зоопатогенных вирусов – выращивание зоовирусов в искусственных условиях, проводится путем заражения животных или культурных клеток и тканей[2].


Культивирование зоовирусов производится в процессе изучения клинической картины и патогенеза вирусных заболеваний, при необходимости диагностики вирусных инфекций, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов[3].

Культивирование зоопатогенных вирусов - Вирус иммунодефицита человека
Вирус иммунодефицита человека


История

Впервые культивирование вируса бешенства осуществил В. Гальтье в 1879 году. Для этого кролик был заражен мозгом больной собаки. А. Левенштейн в 1919 году впервые опубликовал данные об успешной передаче вирусов герпеса к кролику от человека[2].

В. Грютер в 1920 году доказал, что вирус герпеса возможно культивировать на кроликах. Ф. Паркер и В.Н. Най в 1925 году доказали способность вируса коровьей оспы репродуцироваться в тканевой культуре. А.М. Вудрафф и Э. Гудпасчер продемонстрировали возможность культивирования зоовирусов, в частности, вируса оспы птиц, на хорионаллантоисной оболочке эмбрионов кур[2].

В 1954 году американские вирусологи Дж. Эндерс и Т. Уэллер получили Нобелевскую премию за разработку техники культивирования полиомиелита в тканевых культурах[3].

Технологии культивирования

Известно, что вирусы способны репродуцироваться только в живых клетках. Установлено существование трех биологических систем в которых возможно культивирование вирусов вообще и зоовирусов в частности:

  • организм лабораторных животных;
  • развивающиеся куриные эмбрионы;
  • культуры клеток[4][3].

В целях заражения биологической системы конкретным видом вируса из исследуемого материала готовят суспензию. Для освобождения от посторонней микрофлоры (грибов и бактерий) в нее добавляют антибиотики. Готовый материал вводят в биологическую систему[3].

Культивирование зоопатогенных вирусов - Лабораторные животные
Лабораторные животные


Лабораторные животные

В качестве лабораторных животных в вирусологических исследованиях используют белых крыс, белых мышей, морских свинок, золотистых хомячков, кроликов и другие виды[3].

Заражение животных вируссодержащим материалом проводится различными способами: внутримышечно, подкожно, внутривенно, интраназально и прочее. Способ заражения выбирается в зависимости от ткани, поражаемой данным видом вируса (тропизм вируса)[3].

Репродукцию вируса в организме животного оценивают: по развитию видимых клинических симптомов или по патоморфологическим изменениям тканей и органов. Интенсивность репродукции вирусов показывают реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. Данная реакция основана на способности вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих при взаимодействии вирусных белков с рецепторами эритроцитов[3].

Культивирование зоопатогенных вирусов - Заражение развивающегося куриного эмбриона
Заражение развивающегося куриного эмбриона


Развивающиеся куриные эмбрионы

Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) пригодные для вирусологических исследований имеют возраст 5–12 дней. Их использование дает возможность изготовить большое количество вируссодержащего материала и используется при производстве вакцин[3].

Заражения РКЭ производят различными способами:

  • на хорионаллантоиносную оболочку (ХАО);
  • на аллантоисную полость;
  • в амниотическую полость;
  • в желточный мешок;
  • в тело эмбриона[3].

Репродукцию вирусов устанавливают по гибели эмбриона, патологическим изменениям в оболочках и тканях, положительной реакции гемагглютинации (РГА). Гибель эмбриона определяют при прекращении его движения, выявляемое при овоскопировании (просвечивании)[3].

Погибшие эмбрионы вскрывают. Извлекают их содержимое и проводят патологоанатомическое исследование. Эмбриональную жидкость смешивают с эритроцитами для определения гемагглютинации[3].

Культивирование зоопатогенных вирусов - Внутриклеточные включения
Внутриклеточные включения


Культура клеток

Культура клеток является широко используемой биологической системой для культивирования вирусов. Ее получают из органов и тканей животных, птиц, человека. Клетки, полученные из разнообразных тканей и органов теплокровных животных, размножают вне организма в специальной лабораторной посуде на искусственных питательных средах[3].

Питательные среды, используемые для данной цели делят на:

  • ростовые – применяются для выращивания клеточных культур и обогащены сыворотками крови;
  • поддерживающие – применяются для сохранения монослоя клеток после заражения вирусами[3].

При выращивании клеточных культур соблюдаются требования строгой антисептики. Кроме того, используется посуда только из стекла нейтрального состава и сложные по составу питательные среды, содержащие минеральные соли, витамины, аминокислоты, глюкозу, сыворотку крови, буферные растворы. Для успешного выращивания клеточных структур в питательную среду добавляют антибиотики для подавления нежелательной микрофлоры. Оптимум температуры культивирования – + 36ºC–38,5ºC[3].

При заражении культур из сосудов с выросшим монослоем клеток удаляют остатки питательной среды. Затем монослой отмывают раствором Хенкса и вносят в него материал содержащий вирус. Спустя час – полтора остатки вируссодержащего материала удаляют, вносят поддерживающую питательную среду и инкубируют культуру в термостате[3].

Репродукцию культивируемых вирусов оценивают по следующим феноменам:

  1. Цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическомц эффекту (ЦПЭ) – патологические изменения морфологии клеток вплоть до их гибели[3].
  2. Образование внутриклеточных включений. Они могут быть локализованы в ядре и цитоплазме и представлять собой скопление вирусных частиц или отдельных компонентов вируса. Выявляются с помощью микроскопирования[3].
  3. Образование бляшек или негативных колоний под агаровым покрытием. Бляшки являются участками разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое. Они видны невооруженным глазом в форме светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Каждая из них формируется потомством одного вириона. Бляшки, формируемые разными видами вирусов, различают по внешнему виду и срокам появления[3].
  4. Реакции гемадсорбции – способности культур клеток, инфицированных вирусом адсорбировать на своей поверхности эритроциты[3].
  5. Цветная реакция – изменение цвета индикатора, находящегося в питательной среде. Основана на том, что при отсутствии размножения вирусов, живые клетки в результате метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие цвет индикатора. При репродукции вируса метаболизм клеток нарушается. Они гибнут, и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора[3].
 

Оставьте свой отзыв:

Отзывы:

Комментарии для сайта Cackle

Составитель:

 

Страница внесена:

Последнее обновление: 11.05.21 16:50

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Литературные источники:
1.

Карпова О.В. Вирусология, Конспект лекций, Биофак МГУ, Фонд «Вольное дело», 2019 – 161 стр

2.

Леннет Э. Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, пер. с англ. Проф. С.Г. Дроздова. – Москва: Медицина, 1974 – 775 стр

3.

Литусов Н.В. Общая микробиология. Иллюстрированное учебное пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМУ, 2015. – 516 с.

4.

Лысак В.В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. – Минск: БГУ, 2007 – 430 с

Свернуть Список всех источников