К генетическим критериям систематики бактерий относятся: определение относительного содержания ГЦ-пар в ДНК; гибридизация нуклеиновых кислот; определение нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК или РНК, применение генетических зондов (ДНК-зондов), рестрикционный анализ ДНК; методы генетического анализа (изучение переноса генов, генетических скрещиваний, картирование хромосом бактерий)[1].
Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК
Относительное содержание ГЦ-пар в ДНК – это стабильный признак бактерий. Он не зависит от возраста, условий культивирования, отдельных перестроек генов в хромосоме. Данное свойство не изменяется под влиянием большинства мутаций. Эту величину рассматривают как один из важных признаков вида[1].
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличны друг от друга относительным содержанием пуриновых и пиримидовых оснований, формирующих комплементарные пары или ГЦ-пары в антипараллельных цепях ДНК[1].
Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или сходное содержание ГЦ-пар в ДНК. Далеко отстоящие в генетическом отношении микроорганизмы, сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований[1].
Молекулярное содержание ГЦ-оснований у прокариот колеблется в широких пределах: от 25 до 80 мол %. Однако, у разных видов бактерий рода Pseudomonas, количество ГЦ-пар в ДНК характеризуется близкими величинами (61,8 – 69,5 мол % от общего количества оснований). То есть для каждого вида бактерий существует определенное среднее содержание ГЦ-пар[1].
Нуклеотидный состав ДНК бактерий определяют химическими и физическими методами. К химическим методам относят метод хемотографии на бумаге. К физическим – метод определения содержания азотистых оснований по температуре плавления ДНК и метод ультрацентрифугирования ДНК в градиенте плотности хлорида цезия[1].
Строение ДНК
Строение ДНК
1. Дезоксирибоза; 2. Фосфатная группа; 3. Азотистые основания: аденин (A),гуанин (G), цитозин (C),типин (T); 4. Водородная связь[2].
Гибридизация нуклеиновых кислот
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот – более тонкий метод оценки генетического сходства организмов. При помощи данного метода определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов. При помощи гибридизации нуклеиновых кислот впервые произведена количественная оценка родства микроорганизмов. В основе метода лежит способность одноцепочечных ДНК в определенных условиях соединяться с образованием двухцепочечных молекул ДНК[1].
При определении степени генетического родства данным методом ДНК, выделенную из клеток одного микроорганизма, денатурируют при помощи нагревания. Клетки второго штамма выращивают в среде, содержащей радиоактивный предшественник ДНК. В результате этого ДНК становится меченой. Из клеток меченого штамма выделяют ДНК, денатурируют и смешивают с денатурированной ДНК первого штамма. Раствор выдерживается при температуре ниже плавления ДНК. При этом происходит «отжиг» или реассоциация комплементарных цепей с образованием гибридных двухцепочечных молекул ДНК. Одноцепочечные молекулы удаляют[1].
Подобный эксперимент с препаратами ДНК неродственных бактерий, не выявляет ни какой гибридизации. Двойные спирали могут формироваться только при специфическом спаривании цепей, полученных из одной и той же молекулы ДНК[1].
Метод молекулярной гибридизации ДНК не всегда возможно использовать для изучения родственных связей между эволюционно далекими группами бактерий[1].
Приборы для исследований методом ДНК-зондов
Приборы для исследований методом ДНК-зондов
Использование Полимеразной цепной реакции (ПЦР)[2]
Методы генетического анализа
Перенос генетической информации и рекомбинации ее с ДНК реципиента может происходить только между родственными организмами. Межвидовому и межродовому переносу генов могут препятствовать внешние барьеры. Часто это различия в строении поверхностных структур клеток. Таким же препятствием служит и ферментативное расщепление «чужой» ДНК после ее проникновения в клетку. Образование генетических рекомбинатов служит более точным показателем уровня генетической гомологии, чем гибридизация in vitro. Это связано с тем, что включение каждого фрагмента молекулы ДНК донора зависит от степени его родства с ДНК реципиента именно в определенном, специфическом участке хромосомы, в котором и происходит (или не происходит) рекомбинация[1].
Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов)
Метод молекулярных, или генных, зондов (ДНК-зондов) – основан на реакции гибридизации между фрагментом нуклеотидной последовательности (зондом), несущим наиболее специфический и консервативный для данного вида бактерий ген, с ДНК изучаемого микроорганизма[1].
Этот метод позволяет идентифицировать любой биологический объект. Точность метода зависит от чистоты используемого зонда. Лучшими ДНК-зондами считаются полученные путем химического синтеза олигонуклеотидные последовательности с расположением нуклеотидов соответствующим подобному в участке гена (либо всего гена), отвечающего за определенную функцию бактерии[1].
Существуют различные способы метки ДНК-зондов: радиоизотопами, флуоресцентными красителями, биотином[1].
ДНК-полимеразная реакция (ПРЦ)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, при котором малые концентрации определенных фрагментов нуклеиновых кислот в биологической пробе многократно увеличиваются. Это позволяет точнее определить вид или другую систематическую категорию исследуемого биологического объекта[2].
Применение ДНК-полимеразной реакции позволяет значительно увеличить точность метода ДНК-зондов. В основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) лежит многократный процесс удвоения специфического участка нуклеотидной последовательности, ускоряемое по принципу катализа ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, а так же применение соответствующего праймера[3].
Праймер – это фрагмент ДНК, несущий наиболее специфичную для данного микроорганизма нуклеотидную последовательность участка гена или гена в целом. С помощью праймера обнаруживают искомый фрагмент идентифицируемого микроорганизма[1].
Полимеразная цепная реакция (ПРЦ) используется для идентификации ДНК любого организма при наличии соответствующего праймера. Тест-системы с праймерами для проведения ПРЦ в целях обнаружения возбудителей различных заболеваний в последнее время широко внедряются в практику[3].
Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование)
Определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) – метод, позволяющий проводить сопоставительный анализ последовательностей в различных молекулах РНК и ДНК. Секвенирование всего генома бактерии – трудоемкая и дорогостоящая процедура. В этой связи чаще всего анализируются нуклетотидные последовательности рибосомных РНК– 16S-рРНК[1].
Установлено, что 16S-рРНК универсально распространена, функционально постоянна и достаточно консервативна. Чем больше различий в последовательности нуклеотидов данной РНК двух бактерий, тем раньше началось расхождение между ними и тем дальше отстоят они друг от друга в филогенетических отношениях[1].
Статья составлена с использованием следующих материалов:
Литературные источники:
1.Лысак В.В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. – Минск: БГУ, 2007 – 430 с
ООО «ДНК-Технология» Основы полимеразной цепной реакции (ПРЦ), Методическое пособиеСоставитель:ведущий специалист ООО «ДНК-Технология» к. б. н. Зорина Виктория Владимировна, Москва, 2016 – 147 стр.
Источники из сети интернет:
3.
Свернуть
Список всех источников
Оставьте свой отзыв:
Отзывы:
Комментарии для сайта Cackle